•Comprender la estructura de células, tejidos y órganos a niveles no visibles a simple vista. Incluyendo relaciones tridimensionales entre sus componentes bioquímicos.
•Comprender la relación entre la subestructura y las funciones normales de células, tejidos y órganos.
•Establecer una base para el aprendizaje de la histopatología, relación entre las estructuras anormales de tejidos y órganos y los defectos funcionales.
Técnica Histológica:
Métodos Histológicos: Se dividen en 4 grupos:
1.- Microscópia.
2.- Preparación de los tejidos.
3.- Cultivos celulares y tisulares.
4.-Microdisección o fraccionamiento tisular.
Microscopio: del griego micro, pequeño, y skopein, observar.
•El Microscopio es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista.
•Cualquiera de los distintos tipos de instrumentos que se utilizan para obtener una imagen aumentadade objetos minúsculos o detalles muy pequeños de
los mismos.
Microscopía: Historia.
Evolución del microscopio
•El microscopio se invento, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por Jansen, en opinión de los holandeses.
• Antonie van Leeuwenhoeck nacido en Delft en 1632.
Un importante microscopista fue el holandés A. van Leeuwenhoeck (1632-1723) quien, sin ninguna preparación científica, puede considerarse el fundador de la bacteriología. Tallaba el mismo sus lupas sobre esferitas de cristal, cuyos diámetros no alcanzaban el milímetro (su campo de visión era muy limitado, de décimas de milímetro). Con estas pequeñas distancias focales alcanzaba los 275 aumentos. Observó los glóbulos de la sangre, bacterias y protozoos, etc. Durante su vida no reveló sus métodos secretos y a su muerte 26 de sus aparatos fueron cedidos a la Royal Society de Londres.
• Robert Hooke, 1665.
- Marcelo Malpighi, Fue el primero en estudiar tejidos vivos al Microscopio.
Tipos de Microscopios:
•Microscopios ópticos.
• Microscopio simple o lupa.
• Microscopio compuesto.
• Microscopios ópticos especiales
• Microscopio de luz ultravioleta
• Microscopio petrográfico
• Microscopio en campo oscuro
• Microscopio de fase
•Microscopios electrónicos.
• Microscopio electrónico de transmisión.
• Microscopio electrónico de barrido.
• Otros Microscopios
• Microscopio virtual.
Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticas. Los microscopios ópticos o fotónicos se distinguen en microscopio simple o lupa y microscopio compuesto.
• Microscopio simple o lupa: está formado por una lente o un solo sistema de lentes convergentes.
Características:
- •Imagen aumentada, virtual y derecha.
- •Son poco utilizados en histología.
- •Amplían 2,4,8,10 0 20 veces, o algo más.
Microscopio óptico compuesto.
•Consta de dos lentes o de dos sistemas de lentes, ambos convergentes, situados a cierta distancia uno del otro y en un mismo eje.
Caracteristicas:
- •La imagen resultante es virtual e invertida.
- • Con este instrumento se logran aumentos de 50,100 o 1.000 veces, o algo más, según la combinaciónde lentes utilizada y la longitud de onda que se emplea para su iluminación.
- •Se utilizan para examinar cultivos, preparaciones trituradas o una lámina muy fina del material que sea.
Microscopio óptico compuesto.
En el se distingue: la parte mecánica y la parte óptica.
Parte Óptica:
• Objetivo.
Está compuesto por un sistema de lentes convergentes montadas en un tubo metálico.
Por la manera de utilizarse o por alguna característica de construcción, se distinguen:
1) Objetivos a seco. Capa de aire.
2) Objetivos de inmersión. Capa de líquido.
3) Objetivos de corrección. Consigue corregir las desviaciones de los rayos,producidas por el diferente espesor de los cubreobjetos.
•Ocular.
Está destinado a recoger la imagen dada por el objetivo de la que origina una imagen aumentada,virtual y derecha. Está compuesto por dos lentes.
Pueden existir uno (monocular) o dos (binocular).
•Aparato de iluminación.
Fuente de Luz:
1) Luz natural, difusa.
2) Luz artificial.
Tipos de iluminación:
•Iluminación central.
•Iluminación oblicua o lateral.
•Iluminación en campo oscuro (Oblicua externa).
Determinación del aumento del microscopio.
Cuando se conocen los aumentos propios del objetivo y del ocular, que están grabados en las respectivas monturas,
basta multiplicarlos entre sí para determinar el aumento microscópico logrado. Ejemplos:
• Ocular 5 X objetivo10 X, aumento logrado: 50 X
• Ocular 10 XY objetivo 45 X, aumento logrado: 450 X
•
• Ocular 10 XY objetivo 100 X, aumento logrado: 1000 X.
Microscopios ópticos especiales.
Microscopio de luz ultravioleta:
La lente, que habitualmente es de vidrio es sustituida por lentes de cuarzo y la iluminación se produce por unas lámparas de mercurio. no usa filtros y se observa en placas fotográficas.
La variedad de fluorescencia, si usa filtros, y la observación es directa.
El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen determinados aminoácidos.
Microscopio petrográfico:
•Se utiliza para identificar y estimar cuantitativamente los componentes minerales de las rocas ígneas y las rocas metamórficas
Microscopio de campo oscuro:
El microscopio de campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen.•Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminación normal.
Microscopio de fase:
Se utiliza cuando se necesitan ver objetos incoloros.Se usa una iluminación por varios sitios y se miden diferencias de fase para poder "ver" el objeto.
Microscopios Electónicos:
Un microscopio electrónico es un microscopio que utiliza electrones en vez de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos.
El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knollentre 1925 y 1930.
Permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 500.000 aumentos comparados con los 1000 aumentos de losmejores microscopios ópticos).
•Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos:
• Microscopio electrónico de transmisión.
• Microscopio electrónico de barrido.
Preparación de los tejidos para examen microscópico.
El examen de la estructura de la célula, tejidos y órganos puede hacerse de 2 formas:
•Examen al estado fresco, inmediato o in vivo:
• Se realiza sobre el organismo vivo o sobre partes aisladas que sobreviven cierto tiempo.
• Pueden ser teñidas con un colorante vital o no.
•Examen mediato o post-mortem:
• Se realiza sobre elementos que han sido muertos por la fijación y luego teñidos.
Consta de las siguientes etapas:
•Fijación.
•Deshidratación.
•Aclaramiento e infiltración.
•Inclusión.
•Cortes.
•Criofractura y grabado por congelación.
•Montaje.
• Tinción.
Fijación.
•Método histológico de preservación destinado a obtener preparados duraderos que conserven la estructura morfológica y química que presentan las células y tejidos en estado vivo.
•Permite realizar posteriormente los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima.
•Propósito: Conservar la organización estructural del tejido.
•Existen 2 tipos de fijación:
• Fijación química.
• Fijación física o por congelamiento.
•Ventajas y limitaciones:
• Fijación química: Evita la digestión bacteriana y enzimática. Protege la muestra contra daños en los pasos siguientes.
• Congelamiento: Es más rápida. Conserva mejor
Los elementos propios de la célula. Desventaja: Menor duración y dificultad en los cortes.
Cualidades que debe reunir un fijador:
•Actuar con rapidez.
•Alto poder de penetración.
•Conservar en lo posible los detalles estructurales que presentaban in vivo.
•Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos posteriores.
•Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella.
•No dar lugar a la producción de estructuras artificiales o impedirlas.
•No retraer excesivamente los tejidos ni hacerlos friables o quebradizos.
Fijadores químicos.
La mejor fijación se logra a través de la penetración rápida de un fijador en el tejido vivo, mediante inmersión o perfusión.
Pueden ser:
•Simples: Una sola sustancia.
•Formol al 10%.
•Glutaraldehido.
•Acetona en frío.
•Alcohol etílico absoluto.
•Tetraoxido de osmio
•Alcohol metílico.
•Bicloruro de Hg o bicromato de K
•Pueden ser:
•Compuestos o mezclas fijadoras.
•Líquido de Flemming: Mezcla cromo-osmio-acética.
•Líquido de Zenker: Mezcla Bicromato- sublimado-
acética.
•Líquido de Helly. Mezcla Zenker - formol.
•Líquido de Bouin: Mezcla picro-formol-acética.
•Líquido de Duboscq-Brasil.
Esto sirve para completar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos.
Fijadores físicos.
•Pueden ser:
•Desecación. Sangre, líquidos de punción.
•Calor seco. Poco empleado en Histología.
•Calor húmedo: investigaciones microquímicas o para fijar invertebrados.
•Frío. No es un verdadero fijador.
Congelación y desecación: Nitrógeno líquido.
Práctica de la fijación:
•Obtención del material. Biopsia.
• Elección del fijador.
• Tamaño de las piezas. Piezas pequeñas 0.5 a 1 cm.
• Volumen del fijador. 40 a 50 veces el de las piezas.
• Duración de la fijación. poder de penetración del fijador, del volumen de la pieza y de la temperatura de fijación.
•Lavado y conservación de las piezas.
•Deshidratación.
•Consiste en extraer el agua de los tejidos o muestras previamente fijadas. Esta agua impide que sean penetradas por la parafina.
•Propósito: Preparar al tejido fijado químicamente para su infiltración con un medio de inclusión mediante sustitución del agua tisular con un solvente orgánico.
•La deshidratación se obtiene sumergiendo las piezas en líquidos anhidros, ávidos de agua.
•Se aconseja proceder escalonadamente utilizando de preferencia alcohol etílico de graduación creciente:
Alcohol de 70º (1er. baño): 6 horas
Alcohol de 70º (2do baño): 6 horas.
Alcohol de 90° (un baño): 6 horas
Alcohol de 96º (un baño): 6 horas
Alcohol de 100º (1erbaño): 6 horas
Alcohol de 100º (2do baño): 6 horas
•Es fundamental obtener una deshidratación completa.
•Inclusión en bloques de parafina:
•Penetración o infiltración de la parafina.
Se sumergen las piezas en parafina 52º a 55º de punto de fusión.
•Primer baño de parafina:
• Segundo baño de parafina:
Constantemente a 56º.
•Inclusión definitiva o formación del bloque.
• Se colocan las muestras infiltradas en moldesdonde se vierte parafina fundida la cual se solidifica.
•Corte.
El material por examinar no es suficientemente delgado como para que los rayos luminosos puedan atravesarlo o los elementos que lo constituyen no estén dispuestos en una sola capa.
Existen dos procedimientos fundamentales que permiten obtener los cortes deseados:
1) Cortes previa congelación.
2) Cortes previa inclusión.
Se usan aparatos mecánicos denominados micrótomos (del griego mikros, pequeño, y tomé, cortar).
El micrótomo es un dispositivo mecánico que permite la elaboración de cortes finos de muestras para su observación al microscopio.
MICROTOMOS
Montaje:
Obtenidos los cortes histológicos, para poderlos observar al microscopio deben ser colocados sobre una lámina de vidrio (portaobjetos) y despojarlos
de la masa de inclusión.
Tinción:
Se emplean tinciones para localizar y distinguir entre los diversos componentes celulares y tisulares.
Se utilizan colorantes y sustancias químicas para mostrar las subestructuras transparente de los cortes.
•Tinción o coloración:
Es el proceso mediante el cual un cuerpo toma color por la acción de una sustancia colorante y no se destiñe con un lavado efectuado con el solvente empleado para preparar la solución colorante.
•Colorantes:
Sustancias que pueden comunicar su color a otros cuerpos.
•Clasificación de los colorantes:
Según su origen se distinguen:
• Colorantes naturales:
• Animales (carmín).
• Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán).
•Colorantes artificiales o sintéticos:
• Acidos: Sales cuya base es incolora y elácido coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmáticos.
•Básicos: Sales cuya base es coloreada y el ácido incoloro (azul de metileno oclorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
•Neutros: Sales en las cuales tanto el ácidon como la base son coloreados (eosinato de azul de metileno), Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
- Indiferentes: No forman sales. Tiñenaquellas sustancias que tienen poder disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la solución colorante (Sudán 111,rojo escarlata, etc.).
-Sustancias basófilas colorantes básicos.
-Sustancias acidófilas colorantes ácidos
-Sustancias neutrófilas colorantes neutros.
La coloración puede ser:
• Ortocromática: Los tejidos adquieren un color igual al de la solución colorante empleada.
•Metacromática: Una sustancia o un componente celular se tiñe con un color diferente al del colorante.
Cultivos de Tejidos.
Es posible mantener con vida células separadas del organismo y observar in vitro su multiplicación y su comportamiento biológico normal, o estudiar sus
reacciones frente a determinados estímulos, sustancias químicas diversas o parásito (tripanosomas,virus) agregados al medio.
Microdisección o fraccionamiento tisular.
Técnica por medio de la cual a través de la centrifugación se separan los diferentes elementos celulares para su estudio
Evolución del microscopio
1 comentario:
jhoanna sionchez presente
Publicar un comentario